Evaluación del Semen Congelado: Métodos Tradicionales y de Actualidad (Last Updated: 15-Jun-2000 )
H. Rodriguez-Martinez

Department of Obstetrics and Gynaecology, Faculty of Veterinary Medicine, Swedish University of Agricultural Sciences (SLU), Uppsala, Sweden.

Traducido por: H. Rodriguez-Martinez, Departmento de Obstetricia y Ginecología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas (SLU), Uppsala, Suecia. (10-Jul-2000).

Resumen
El método más usado para determinar la calidad del semen de toro procesado para inseminación artificial (IA) es la evaluación subjetiva de la motilidad espermática. A pesar de ser un buen indicador de la viabilidad espermática y por ende relevante para la fertilidad, la motilidad espermática post-descongelado no es capaz de predecir el nivel fecundante de la muestra de semen para IA. Dichos niveles de capacidad fecundante son obtenidos mediante la IA de varios cientos o miles de hembras. Este procedimiento, aun que seguro, es de alto costo. A raíz de ello, la investigación en esta área intenta obtener métodos alternativos, o al menos complementarios, de evaluación seminal in vitro. La presente revisión describe estos métodos, particularmente aquellos que evalúan la funcionalidad espermática del semen bovino criopreservado y su relación con la fertilidad post-IA. La combinación de resultados analíticos in vitro de un grupo de parámetros de función espermática postdescongelado, tales como la motilidad linear, la concentración total y de espermatozoides móviles luego de efectuado un "swim-up", la frecuencia de espermatozoides no-capacitados (estables), la capacidad de su acrosoma para reaccionar ante la exposición a ionóforos, el grado de estabilidad de la cromatina así como su habilidad para unirse a la zona pelúcida (ZP) de ovocitos homólogos (test de unión a ZP, ZBA) y de fertilizarles in vitro (FIV); ha sido relacionada (retrospectivamente) en forma significativa con la fertilidad a campo registrada luego de la IA usando el semen de dichos toros. Aún más, valores predictivos de fertilidad han sido obtenidos mediante la evaluación in vitro del semen criopreservado, indicando que es posible eliminar toros subfértiles antes de que su semen ingrese a un programa de inseminación artificial.

Inseminación artificial (IA): la biotecnología reproductiva de mayor suceso en el bovino
La IA juega un doble papel en los programas de mejoramiento genético en ganado vacuno. Primero, previene la difusión de enfermedades venéreas y, segundo, disemina efectivamente el material genético deseable de ciertos toros probados dentro de una población de hembras, incrementando en última instancia su estado de salud y la ganancia genética de enormes poblaciones vacunas (más de 150 millones de hembras vacunas son anualmente inseminadas artificialmente con semen criopreservado en el mundo). Para garantizar el mayor resultado posible de la IA, estos toros genéticamente seleccionados para los programas de mejoramiento genético son monitorizados andrológicamente para definir su aptitud reproductiva y de aquellos considerados normales o aptos para la reproducción, se colecta semen que es examinado en forma periódica para determinar su normalidad previo al procesado, el cual se lleva a cabo usando los mejores métodos de preservación accesibles en el momento, incluyendo la criopreservación y el descongelado. Por último, el semen procesado es depositado en la hembra mediante IA teniendo en consideración que la deposición seminal se realice lo más próximo posible, en términos temporales, a la ocurrencia de la ovulación. Sin embargo, aún cumpliendo con estos prerequisitos, la fertilidad que se considera aceptable luego de la primera IA se encuentra situada en niveles de tasas de no retorno al celo, 56 días después de efectuada la IA, del > 60 %. A pesar de que muchos factores inciden en la fertilidad por IA, la capacidad fecundante del semen criopreservado es, probablemente, la de mayor importancia.

La capacidad fecundante del semen es afectada por la criopreservación
El espermatozoide es una célula terminal, cuyo rol principal es el transporte de un paquete, constituído por el genoma nuclear y el centríolo, hasta el ovocito. Para realizar esta tarea, el espermatozoide está equipado con una batería de estructuras especializadas (una membrana plasmática que muestra áreas delimitadas, organelos con disposición específica tales como la vaina mitocondrial, y especializaciones de los mismos tales como el flagelo y el acrosoma) los que garantizan la interacción particular con el tracto genital femenino y el ovocito y sus envolturas. La viabilidad celular espermática decrece rápido y substancialmente luego de la ejaculación. La criopreservación, cuyo propósito es garantizar su sobrevida, ocasiona sin embargo daño irreversible a las membranas plasmáticas causando ya sea la muerte celular [1] o cambios parecidos a los que se ven durante la capacitación espermática [2], que dificultan or previenen su capacidad para interactuar con el ovocito durante la fertilización. Para poder maximizar el número de inseminaciones artificiales que pueden ser llevadas a cabo con un único eyaculado de un toro probado, la industria vinculada a la IA ha disminuído -en forma progresiva y como consecuencia del uso de mejores métodos de congelación- el número de espermatozoides en sus dosis de IA. Números de 7,5 - 10 millones de espermatozoides por dosis son hoy día comunes [3]. Si bien los procesos de congelación y descongelación afectan una gran proporción de los espermatozoides, existe una gran variación entre individuos, algunos siendo menos afectados que otros. Para cada toro existe, por ende, un cierto número de espermatozoides que mantienen viabilidad al descongelado y en consecuencia un número límite inferior en cada dosis, que garantiza la expresión de un cierto nivel de fertilidad, el cual generalmente define cada individuo. Por debajo de este número límite de espermatozoides, cuanto menos sean los espermatozoides viables a inseminar, mayor será el riesgo de que la fertilidad disminuya [4]. Una relación estadísticamente significativa existe entre el número de espermatozoides inseminados y la fertilidad post-AI, que sigue, en forma linear, el nivel de fertilidad de cada toro [3,5]. Considerando la importancia biológica y económica que implica conocer en forma certera la fertilidad potencial del semen de IA antes de la inseminación, innumerables esfuerzos han sido realizados en el mundo entero para diseñar métodos de evaluación in vitro que puedan explorar aspectos de la estructura espermática y su función que puedan, debido a su relación con la fertilidad, ser aplicados a una subpoblación de espermatozoides procesados como semen para IA, a fin de poder determinar su fertilidad potencial si se inseminan en una hembra.

Evaluación tradicional del semen congelado de toro
Para garantizar la fertilidad del semen de toro congelado para IA, y de esa forma promover la diseminación eficiente de un material genético deseable presente en los reproductores probados, a un rodeo de cría, los eyaculados criopreservados de toros de IA son solamente evaluados -en forma rutinaria- por sus niveles de motilidad espermática post-descongelado. Dicha evaluación es realizada, comúnmente, en forma subjetiva, por medio de la observación de frotis húmedos en un microscopio de luz equipado con óptica de contraste de fases. Por ende, los resultados obtenidos dependen enteramente de la habilidad y experiencia del evaluador. El método es simple, sencillo y rápido y todavía constituye el parámetro de elección para determinar el grado de daño celular que los procedimientos de criopreservación, especialmente bajo condiciones industriales, inflijen a los espermatozoides. Hay reportes en la literatura que describen una relación significativa entre la motilidad evaluada subjetivamente y la fertilidad a campo [6], aunque estas correlaciones no son altas (particularmente cuando los rangos de motilidad están alrededor o por encima del 50%) [7], y no necesariamente se encuentran en diferentes poblaciones de ganado [8,9]. Más y más centros de toros incorporan al presente analizadores de motilidad espermática computarizados (los llamados instrumentos CASA), con el propósito de tener una mayor objetividad en la evaluación seminal y la posibilidad de analizar los diferentes patrones de motilidad espermática que se encuentran en una muestra de semen, particularmente luego de su procesado. La linearidad del movimiento espermático, por ejemplo, parece estar relacionada significativamente con la fertilidad a campo [10,11]. La medición del contenido de ATP mediante luminometría pueden determinar, indirectamente, el número de espermatozoides viables, en forma más exacta que por intermedio de la evaluación visual de motilidad [12] pero no parece estar correlacionado con fertilidad [4]. La evaluación de la morfología espermática es un importante componente del espermiograma, cuya desviación de la normalidad indica la presencia de patologías testiculares o epididimarias [9,13]. La morfología también puede usarse como indicador de la habilidad de los espermatozoides para sobrellevar los procesos de congelado y descongelado, usando por ejemplo la apariencia de los acrosomas o la presencia de colas dobladas simples para indicar daños a nivel de membrana o del flagelo, respectivamente [14] y de esa manera nor permite evitar el uso de cierto semen procesado para IA.

Nuevos métodos para la evaluación del semen congelado de toro
Como se ha mencionado anteriormente, los espermatozoides de toro tienen una estructura especializada y diferenciada para participar en el proceso de fecundación. La evaluación de la integridad y el grado de funcionalidad de diferentes parámetros espermáticos, considerados pre-requisitos para la fecundación debido a su rol en la interacción espermatozoide-tracto genital femenino o espermatozoide-ovocito [8] ha sido, por consiguiente, considerada prioritaria.

Evaluación de la viabilidad espermática
La integridad de la membrana plasmática ha sido uno de los parámetros más estudiados, por su rol preponderante actuando como límite celular y responsable de hacer efectivas las interacciones entre células, tanto en términos de integridad morfológica como funcional [revisado por 15]. La evaluación morfológica, ya sea usando incremento óptico (por ejemplo con el uso de óptica de contraste diferencial de interferencia, o Nomarski), las coloraciones (combinaciones supravitales; tales como el verde rápido/eosina, eosina/azul de anilina, azul tripán/Giemsa o el amarillo de naftol/eritrosina) para el examen de microscopía óptica o la microscopía electrónica (de trasmisión o de barrido) ha sido valiosa para determinar aspectos de integridad espermática. Sin embargo, la mayor parte de estas técnicas proveen ya sea de información parcial y/o son tediosas, costosas o ambas. Además, aún cuando algunas técnicas morfológicas proveen información de detalles de los daños inflictos a la membrana plasmática, estos resultados no siempre están correlacionados con la fertilidad del toro en cuestión, a menos que el daño presente en el semen sea muy importante. La frecuencia de espermatozoides criopreservados con membrana plasmática intacta puede ser fácilmente determinada usando tests muy sencillos y prácticos como los de resistencia a cambios osmóticos (los llamados ORT), que se basan en la reacción de las membranas de los espermatozoides cuando se exponen a soluciones salinas hipo-osmóticas [16,17]. Desafortunadamente, los resultados de este tipo de test no siempre correlaciona con la fertilidad de las muestras investigadas. Un gran avance en la evaluación funcional de los espermatozoides criopreservados de toro ha sido el desarrollo de marcadores fluorescentes para el ADN, enzimas intracitoplasmáticas, lectinas o el potencial de membrana [15].
En particular, el uso de estos fluoróforos (simples o en combinaciones) han mostrado ser de alto valor para determinar la integridad de los distintos compartimientos subcelulares (funcion mitocondrial [Rhodamina 123], la integridad del plasmalema [fluoresceinas, marcadores de ADN]). Los fluoróforos han sido usados en conexión con microscopía de fluorescencia (donde se requiere un operador para el recuento). Aunque esta metodología es más barata, sólo permite la evaluación de unos cientos de espermatozoides por muestra, dejando a a la misma con un grado de exactitud muy por debajo de la citometría de flujo (usando los llamados analizadores de FACS), tecnología que permite el examen de miles de espermatozoides en minutos, con una buena correlación con fertilidad [17,21], La evaluación de la integridad de membrana por fluorometría, examinando altas concentraciones de espermatozoides se refleja en una relación con fertilidad, (pero de baja significancia estadística, [11]), una relación que no estuvo presente cuando se usó microscopía de fluorescencia para evaluar la viabilidad espermatática [18]. La integridad del acrosoma post-descongelado puede también ser determinada morfológicamente, usualmente a niveles de microscopía óptica, tanto en mustreas no teñidas como en muestras teñidas con diferentes tinciones empíricas (siendo Giemsa el más comúnmente utilizado). El estado de los acrosomas ha sido retrospectivamente correlacionado (estadísticamente significativo) con la fertilidad del semen congelado [19] Fluoróforos y lectinas tambén han sido aplicados a este nivel con buenas correlaciones con fertilidad [20,21]. La integridad del acrosoma del semen de toro post-descongelado también puede evaluarse indirectamente midiendo la presencia de enzimas intraacrosomales en el medio seminal (tales como las amidasas, la acrosina o las lactodehydrogenasas) [22].

Evaluación del estado de la cromatina
. Respecto al estado de la cromatina espermática, la evaluación del grado de denaturalización del ADN usando citometría de flujo (el llamado método de SCSA, [23]) parece ser un complemento invaluable para la evaluación microscópica de la morfología espermática del semen de toros en esquemas de producción seminal, ya que algunos de los parámetros testados tienen relación significativa con la fertilidad de los reproductores [11].

Relación con la fertilidad de los toros despues de la IA
Como se ha descrito anteriormente, pocos parámetros individuales de viabilidad espermática muestran una relación significativa con la fertilidad de la muestra de semen descongelada, especialmente si los porcentajes de viabilidad se encuentran dentro de límites de normalidad aceptables [24]. Por lo tanto, tests funcionales in vitro, capaces de discernir la habilidad del semen descongelado para llevar a cabo procesos celulares específicos y complicados como la capacitación, la unión a la zona pelúcida (ZP), la reacción acrosomal, la fecundación in vitro (FIV) y la inducción del desarrollo embrionario in vitro han sido diseñados y testados para determinar su relación con la fertilidad obtenida luego de la IA.

Evaluación de cambios similares a la capacitación espermática y la inducción de la reacción acrosomal
La capacitación espermática (y la reacción acrosomal) pueden ser visualizadas indirectamente luego de la incubación de espermatozoides viables con el antibiótico fluorescente clorotetraciclina (CTC), que emite fluorescencia mientras monitora el desplazamiento de Ca++ en la parte interior de la membrana de la cabeza espermática. Los análisis de espermatozoides descongelados de toro mediante CTC han mostrado que el proceso de criopreservación induce cambios en los espermatozoides similares a los que aparecen durante el dinámico proceso de capacitación [2]. En toros de IA con fertilidad conocida, hasta un 30 - 40 % de los espermatozoides procesados rutinariamente muestran cambios similares a la capacitación [25]. Aun más, el porcentaje de espermatozoides no capacitados (no reactivos) en muestras de semen para IA fué un parámetro correlacionado en forma significativa con la fertilidad del semen post-IA [25]. La reacción acrosomal (RA) puede ser inducida in vitro por la exposición a glicosaminoglicanos (GAGs) tales como la heparina [21,26]. El grado de RA luego de la exposición de semen descongelado de toro a heparina fue significativamente correlacionado con la fertilidad in vivo [21]. Las reacciones acrosomales pueden ser también inducidas mediante un tratamiento con ionóforos de calcio (como el Hoechst A23187, por ejemplo). Correlaciones significativas entre el grado de inducibilidad de la RA con fertilidad (tasas de no retorno de los toros post-IA) han sido descritas [27], incluso a niveles predictivos [20].

Habilidad del espermatozoide para unirse a la zona pelúcida (Tests de unión spermatozoide-ZP)
Dos tipos de tests de unión spermatozoide-ZP han sido probados para el espermatozoide bovino, uno usando ovocitos homólogos intactos (no divididos [ZBA]) [28,29] y el otro usando hemizonas (de ovocitos divididos por microbisección), el llamado test de hemizona (HZA) [30], donde cada mitad de la ZP es incubada con espermatozoides de una muestra control ya con una muestra a evaluar, respectivamente. Corrrelaciones significativas con la fertilidad post-I han sido obtenidas usando ambos tipos de tests de unión espermatozoide-ZP [30,31] (Fig. 1). El método primeramente descrito (ZBA) es, sin embargo, mucho más sencillo, menos tedioso y exacto que el HZA, siempre y cuando un número importante de ovocitos se incluyen en cada test, para disminuir la variación entre ovocitos [29].

Figura 1. Relación (r= 0.50, P= 0.02, n=22) entre el número (promedio) de espermatozoides unidos a la zona pelúcida (ZP) y la fertilidad de los toros testados en IA (tasa (%) de no retorno al celo 56 días despues de IA) (modificado, de [31]). Las líneas internas marcan un nivel deseable de fertilidad post-AI y el número promedio de espermatozoides unidos a la ZP.

Relaciones entre el desarrollo embrionario in vitro (FIV) y la fertilidad post-IA
El uso de espermatozoides de un toro determinado afecta los resultados de FIV, aunque una relación estadísticamente significativa entre la fertilidad in vitro e in vivo no ha estado siempre presente [32-39]. Estudios retrospectivos del semen criopreservado de toros con un rango amplio de fertilidad post-IA han demonstrado una correlación positiva y estadísticamente significativa entre tasas de clivaje zigótico in vitro y las tasas de no retorno al estro 56 días despues de la IA [38] (Fig. 2). Evaluando los resultados a nivel de la producción de blastocistas in vitro, la correlación con la fertilidad in vivo existió, pero con coeficientes de correlación mas bajos, probablemente debido a la mayor dependencia por parte del embrión temprano de las condiciones de cultivo que de la fuente de los espermatozoides, para alcanzar el estadio de blastocista.

Figura 2. Relación (r= 0.59, P<0.001) entre la tasa (%) de clivaje zigótico (48 h post-FIV) y la fertilidad post-IA de las operaciones de congelación testadas (tasa [%] de no retorno al celo 56 días post-IA), 2-4 operaciones/toro, 15 toros (modificada, de [38]).

Valor pronóstico de los tests in vitro
Como se ha descrito anteriormente, pocos parámetros espermáticos individuales evaluados in vitro se relacionan estadísticamente con la fertilidad in vivo. Sin embargo, combinando los resultados de algunos análisis seminales incluídos en un análisis de regresión múltiple ha demostrado tener una relación significativa con la fertilidad de los toros evaluados [8,11,38,40] (Fig. 3)., con poder discriminativo, aunque de carácter retrospectivo. Teniendo entonces en cuenta que los análisis de correlación no tienen carácter prospectivo, o sea que no son predictivos per se, métodos de evaluación seminal in vitro que incluyen los tests de unión a la ZP y la FIV han sido usados, como se mencionó anteriormente para calcular una fertilidad potencial esperada para semen congelado de toros jóvenes (11-13 meses) que entraban la evaluación de fertilidad prerequisito para el test de progenie [41]. Los resultados de dichos métodos de análisis fueron combinados para calcular un valor predictivo y una fertilidad potencial esperada (como tasas de no retorno) antes de que la fertilidad real a campo de dichos reproductores fuera conocida [41]. Cuando las cifras de no retorno reales furon obtenidas, las cifras calculadas mostraron una fuerte relación con la fertilidad post-IA (Fig. 4). Este procedimiento indica además que es posible el uso de una combinación de tests de laboratorio para determinar la calidad seminal y para predecir la fertilidad potencial de un toro para IA, particularmente para separar aquellos con baja fertilidad de los de fertilidad promedio buena o alta (Fig. 4), los que generalmente son la mayoría en las poblaciones actualmente en uso. Su valor como herramienta útil para la evaluación del semen de toros jóvenes reside por ende en el interés de eliminar aquellos toros jóvenes con una menor fertilidad potencial de los tests de progenie, de modo de permitir el uso más efectivo del espacio, físico y especialmente económico, que estos tests implican. Esta práctica conduce, sin duda alguna, a ganancias económicas y genéticas de alto valor y beneficio.

Figura 3. Relación entre la fertilidad (%) predicta in vitro, combinando el análisis de cuatro parámetros espermáticos (motilidad espermática post-descongelado, motilidad linear [CASA], estabilidad de la cromatina [SCSA] e integridad de membrana [Fluorometría]) evaluados in vitro con la fertilidad registrada (tasa de no retorno al celo 56 días post-IA) por las operaciones de congelado testadas (r=0.75, P<0.001). La línea muestra la tendencia de los datos (Modificada [11]).

Figura 4. Relación predictiva (r= 0.94, p= 0.0001) entre fertilidad in vitro (calculada por la combinación de 7 parámetros espermáticos estadísticamente relacionados con fertilidad, analizados in vitro en 3 oparaciones de congelación/toro) y la fertilidad total de los toros (tasas [%] de no retorno al celo 56 días post-IA). El testaje in vitro fué capaz de identificar un toro subfértil, por debajo del límite de sub-fertilidad predicto (62%), mientras que los demás toros aparecían ya in vitro con un nivel aceptable de fertilidad (alrededor de 65%) que fue confirmado in vivo (modificado, de [41]).

Agradecimientos
Los estudios de invetisgación del autor y colaboradores han sido financiados por el Consejo Sueco de Investigación Forestal y de Agricultura (SJFR), y la Fundación Sueca para Investigación Agrícola (SLF), Estocolmo, Suecia.